基因检测与转基因检测

1.1酶联免疫法(ELISA)

ELISA检测是将抗原和抗体反应的特异性与酶对底物的高效催化作用结合起来，根据酶作用于底物后的显色反应，当抗原与抗体结合时，借助于比色或荧光反应鉴定GMF。酶与底物反应的颜色与样品中抗原的含量成正比。ELISA检测对样品进行定性检测的同时又能进行定量分析。Rogan等人用ELISA法检测出传统大豆加工产品中混有2％Roundup Ready大豆中的CP4 EPSPS蛋白质。此方法具有选择性和灵敏性，具有商业可利用性；但是复杂基质对它的准确性和准确度有干扰，并且外源基因表达的蛋白质在较低水平或热处理变性时，免疫方法的检测能力就会下降。

1.2试纸法

主要将特异的抗体交联到试纸条上和有颜色的物质上，当纸上抗体和特异抗原结合后，再和带有颜色的特异抗体进行反应，就形成了带有颜色的三明治机构，并且固定在试纸条上，如果没有抗原，则没有颜色。此法不需要特殊的仪器设备，适用于现场检验或初筛。

上面两种方法有三方面不足：第一，抗原抗体反应的专一性；第二，加工过的转基因食品中的蛋白质抗原性很容易破坏，从而影响检测结果的准确性；第三，有些转基因食品不表达蛋白质或表达量很低或很大时，则无法进行检测。

1.3蛋白质印迹法(Western Blot)

蛋白质印迹法将电泳较高的分离能力、抗体的特异性和显色酶反应的灵敏性结合起来，是检测复杂混合物中特异蛋白质最有力的工具之一，普遍用于分离、检测特异的目的蛋白质，灵敏度为1～5ng。它可确定一个样品中是否含有低于或超过预定限值水平的目的蛋白质，特别是用于不可溶蛋白质的分析。Van Duijn等人用蛋白质印迹法检测Roundup Ready大豆中的 CP4合成酶，检测限在0．5％～l％。经验证，这种方法可以应用于转基因Roundup Ready大豆原材料和大豆蛋白质产品的检测。

ELISA检测目前已有商品化的转基因食品 ELISA检测试剂盒，但只能检测少数几种转基因食品，且一种试剂盒只针对一特定转基因产物，无法高通量、快速地检测具有多种混合成分的食品样品，并且价格很高。蛋白质芯片技术将是未来筛选食品中多种转基因成分的最佳方法。

2核酸水平的检测

2.1定性PCR

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是以特定的基因片段(DNA片断)为模板，利用人工合成的一对寡聚核苷酸为引物，以4种脱氧核苷酸(dNTP)为底物，在耐高温聚合酶的作用下，通过DNA模板的变性、退火及引物的延伸3个阶段的多次循环，使模板扩增。

转基因细胞转入的基因成分一般包括启动子(Promotor)、报告基因(Repo~er Gene)、目的基因(Target Gene)、终止子(Terminator)，其中启动子和终止子为表达目的基因所必需的。至今，转基因植物常用的是花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子(NOS)。通过PCR扩增这些特殊的启动子和终止子序列，是目前最常用的鉴定食品中有无转基因成分的方法。Shirai等通过对35S启动子、NOS终止子的检测，实现了对抗草甘膦大豆Roundup Ready转基因成分的筛选检测。曹际娟等对转基因玉米及其粗加工食品，如爆米花、熟玉米棒、速溶玉米片的基因进行了PCR定性检测。但定性的PCR方法对转基因玉米原材料的灵敏度比转基因大豆原材料略低(如检测O.1％的转基因玉米种的35S启动子的假阴性数量是14个，而相应的转基因大豆的35S启动子的假阴性数量是5个)。PCR方法已经发展为检测转基因Round—up Ready大豆的方法，呈现高度特异性和敏感度(O.01％GMF)，适用于从大豆到豆制品、大豆蛋白质、卵磷脂及豆油的半成品和终产品样品。

2.2多重PCR

多重PCR是常规PCR方法的改进，它是在同一个反应中同时扩增两个或多个目标基因序列。这种方法具有更大的可靠性和适应性，并且能降低检测成本。张平平等为了同时检测转基因食品中所含的多个目标基因序列并排除扩增结果的假阴性，采用多重PCR分析技术对转基因大豆食品进行了检测，当转基因大豆含量仅为O．15％时，仍然可以对转基因食品进行可靠的鉴定，从而表明该方法的高度敏感性。Permingeat等仅用两对引物就可同时检测出转基因玉米Btl76、MON810、 Btll和T25的CrylA(6)和pat基因。多重PCR也可同时准确地扩增出Roundup Ready大豆的NOS和epsps序列片段。刘光明根据转基因农作物中常用的花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子(NOS)的序列，设计并合成了两对不同的引物和相对应的两种荧光双链探针(FDCP)，分别建立了常规PCR、应用FDCP的新型实时荧光 PCR检测转基因成分35S启动子和NOS终止子的方法。试验结果表明，建立的多重PCR方法能有效检测出35S和NOS成分，其中多重PCR法具有灵敏度高、特异性好的特点，多重荧光PCR法则更为简便、快速、准确。

2.3电化学发光PCR技术

电化学发光(Elec— trochemiluminescence，ECL)是指通过电化学方法产生一些特殊的物质，然后这些电生物质之间或电生物质与其他物质之间进一步反应产生的一种发光现象。它是化学发光与电化学方法相互结合的产物。电化学发光PCR法首次将电化学发光技术、PCR技术和双探针杂交技术结合起来，用于检测CaMV35S启动子，从而判断其是否含有转基因成分。刘晋峰等首次利用该方法检测到35S启动子的存在，并且该方法所用的试剂中没有电泳检测中用到的溴化乙锭、同位素等毒害物质。与传统的凝胶电泳检测方法相比，该法操作简便，检测转基因植物具有较宽的线性度，可望将其发展成为一种定量检测转基因植物的方法。

2.4定量PCR

由于PCR具有敏感性和特异性的特点，而且食品加工过程中核酸变性程度不如蛋白质，因此目前GMF的定量仍基于PCR，其中包括半定量PCR法(semi—quantitative PCR)、定量竞争PCR法(Quantitative Competitive PCR)、实时荧光定量PCR法(Real—time Fluorescence Quantitative PCR)。

上述几种传统定量PCR法，一直面临着两大难题，即PCR的假阳性污染和定量的准确度。用这些方法进行检测，都依赖于各种不同类型的PCR后处理过程，而这些处理过程很易使数量巨大的PCR产物飞散到空气中，使PCR假阳性污染成为可能，并且所有这些方法的定量都是针对PCR终产物来进行的，而PCR的平台效应在一定程度上干扰了PCR的原始模板数量和终产物之间的相关性，使定量准确度难以提高。

2.5Southern

Southern杂交是通过对特异性探针结合的基因组DNA片断内或其周围序列进行限制性内切核酸酶酶切位点作图来研究基因在基因组内部是如何组织排列的。在转基因食品中用 Southem技术，是要在知道该转基因食品转入外源基因片段的情况下使用的。该技术可检测出食品外源基因与内源基因有高度同源性的DNA片断，且准确可靠，但对样品的纯度要求较高。

2.6Northern

与Southem不同，Southern是以 DNA为杂交对象，而Northern杂交对象是转基因食品里的RNA。

2.7基因芯片

基因芯片是20世纪80年代末在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列的矩阵，基因芯片可以将目前通用的报告基因、抗性基因、启动子和终止子的特异片段(靶片段)固定于玻片上制成检测芯片，将从待检样品中提取的DNA扩增、标记后与芯片进行杂交，杂交信号由芯片扫描仪检测，再经计算机软件进行分析判断。基因芯片技术可对样品进行集约化和平行处理。

随着转基因食品的迅速发展，转基因食品检测技术也在飞速发展。近几年，基因芯片技术和DNA生物传感器等新技术的研究取得了新的进展，利用基因芯片和生物传感器技术是今后一段时间内转基因监测技术的研究方向之一。同时高通量、高灵敏度、自动化和低成本的检测技术是未来的发展趋势。